Um experimento desenvolvido em 1957 no instituto de tecnologia da califórnia conduzido pelos americanos Matthew Meselson e Franklin Stahl conseguiu demonstrar pela primeira vez, que a replicação do DNA é semiconservativa. O sucesso desse experimento foi o uso de um isótopo “pesado” de nitrogênio - o nitrogênio pesado (¹⁵N) é um raro isótoporo não-radioativo que torna as moléculas que o contêm mais densas do que as moléculas quimicamente idênticas contendo o isótopo com, (¹⁴N). Para distinguir DNA de diferentes densidades (isto é, DNA contendo ¹⁵N versus DNA contendo ¹⁴N), os pesquisadores inventaram um novo procedimento de centifugação usando uma solução de cloreto de césio (CsCl). Centrifugando solução ou suspensões em alta velocidade em uma centrífuga, os solutos ou partículas se separam e formam um gradiente de acordo com a sua densidade. Uma solução concentrada de CsCl possui uma densidade muito próxima da do DNA. Em alta força gravitacional, os íons de césio se sedimentam fora da solução, estabelecendo um gradiente partindo de uma densidade baixa na parte superior do tubo de centrifugação para uma densidade alta na parte inferior do tubo. Quando uma amostra de DNA é dissolvida em CsCl e centrifugada em torno de cem mil vezes a força da gravidade, o DNA se agrega em uma faixa na posição do tubo onde a densidade da solução de CsCl se iguala a sua própria densidade.

Instituto de Tecnologia da Califórnia, nos Estados Unidos

 

              

       Franklin Stahl (1929 - )                                                       Matthew Meselson (1930 - )

 

Após desenvolver esse método para distinguir densidades de DNA, Meselson e Stahl cresceram uma cultura de bactérias Escherichia Coli por 17 gerações em um meio onde a fonte de nitrogênio (cloreto de amônia - NH₄Cl) era composta por ¹⁵N no lugar de ¹⁴N . Como resultado, todo DNA das bactérias era “pesado”. Eles cresceram outra cultura em um meio com ¹⁴N e extraíram DNA de ambas as culturas. Quando os extratos foram combinados e centrifugados com CsCl, formaram duas faixas separadas de DNA, demonstrando que esse método poderia distinguir amostras de DNA com pequenas diferenças de densidade.

A seguir, Meselson e Stahl cresceram outra cultura de E. coli em meio contendo ¹⁵N e então transferiram-na para um meio normal contendo ¹⁴N e continuaram crescendo a bactéria. Nas condições usadas por eles, a E. coli replica o seu DNA a cada 20 minutos. Meselson e Stahl coletaram algumas das bactérias após cada divisão e extraíram o DNA da amostra.

Meselson e Stahl observaram que a faixa de DNA no gradiente de densidade era diferente em cada geração de bactérias. No momento da transferência, o DNA era uniformemente marcado com ¹⁵N e, em consequência, era relativamente denso. Após uma geração, quando o DNA havia se replicado uma vez, todo o DNA estava com uma densidade intermediária. Após duas gerações, havia duas faixas de DNA igualmente grandes: uma de baixa densidade e uma de densidade intermediária. Em amostras de gerações subsequentes, a proporção de DNA de baixa densidade aumentou constantemente.

Os resultados desse experimento podem ser explicados pelo modelo semiconservativo de replicação do DNA. O DNA de alta densidade possuía duas fitas com ¹⁵N, o DNA de densidade intermediária possuía uma fita com ¹⁵N e uma com ¹⁴N. No primeiro ciclo da replicação do DNA, as fitas da dupla-hélice - ambas pesadas com ¹⁵N - se separaram. Enquanto separadas, cada fita atuava como molde para a segunda fita, que continha apenas ¹⁴N e, consequentemente, era menos densa. Cada dupla-hélice então consistia de uma fita ¹⁵N e uma ¹⁴N e era de densidade intermediária. Na segunda replicação, a fita contendo ¹⁴N dirigiu a síntese da outra fita com ¹⁴N, criando o DNA de baixa densidade, e as fitas ¹⁵N ganharam novas parceiras ¹⁴N.

A observação crucial na determinação do modelo semiconservativo foi de que o DNA de densidade intermediária (¹⁵N-¹⁴N) apareceu na primeira geração e continuou a aparecer em gerações subsequentes. Com os outros modelos, os resultados deveriam ter sido um pouco diferentes. No modelo conservativo, a primeira geração deveria ter apresentado ambos, DNA de alta densidade (¹⁵N-¹⁵N) e DNA de baixa densidade (¹⁴N-¹⁴N), mas não DNA intermediário. No modelo dispersivo, a densidade do novo DNA deveria ter sido entre o baixo e o alto e não exatamente intermediário.

Logo após Meselson e Stahl publicarem seu trabalho, outros cientistas demonstraram que a replicação semiconservativa ocorre no DNA das células eucarióticas de plantas e de animais. Utilizando DNA marcado, eles até demonstraram que as cromátides parecem se replicar semiconservativamente, proporcionando a primeira evidência de que uma cromátide é uma molécula única de DNA dupla-hélice.

 

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